Pengenalan
Pankreatitis akut (AP) adalah penyakit di mana pankreas "mencerna" dirinya sendiri, terjadi akibat pengaktifan trypsin yang boleh disebabkan oleh pelbagai faktor. Ini adalah masalah kesihatan yang serius dan merupakan salah satu sebab utama kemasukan ke hospital berkaitan isu gastrointestinal. Dari jumlah pesakit yang didiagnosis dengan AP, sekitar 20% berpotensi mengalami perkembangan ke pankreatitis akut yang teruk (SAP), yang boleh menyebabkan komplikasi lokal atau sistemik dan sering memerlukan tindakan invasif. Kadar kematian untuk SAP boleh mencapai 30%. Rawatan yang ada untuk AP kebanyakannya bersifat sokongan dan bukan spesifik, penting kerana penyakit ini boleh berkembang dengan cepat dan tidak terduga. Oleh itu, penting untuk memahami mekanisme molekul yang terlibat serta mencari biomarker dan sasaran terapeutik baru.
Banyak kajian menunjukkan bahawa RNA tidak penyandi (ncRNAs), termasuk RNA panjang (lncRNAs), RNA bulat (circRNAs), dan mikroRNA (miRNAs), mempunyai peranan penting dalam kemunculan dan perkembangan pelbagai penyakit termasuk kanser paru-paru, penyakit radang usus, penyakit kardiovaskular, dan gangguan pankreas. Ekspresi ncRNAs diatur dengan ketat dalam keadaan fisiologi normal, jadi perubahan dalam ekspresinya berpotensi sebagai biomarker diagnostik atau sasaran terapeutik. Beberapa lncRNAs telah didapati terlibat dalam mekanisme patofisiologi pankreatitis akut (AP) dengan mempengaruhi proses seperti pengaturan polariti makrofaj, pemeliharaan motilitas gastrointestinal, dan penginduksian kecederaan paru-paru berkaitan pankreatitis. Misalnya, dalam tindak balas keradangan pada AP, lncRNAs terutama memodulasi jalur NF-κB, yang selanjutnya mendorong pengeluaran faktor keradangan dan mempromosikan polaritas makrofaj M1. Malangnya, peranan lncRNAs pada peringkat awal pankreatitis akut (AP) masih belum dianalisis secara menyeluruh.
LncRNAs berinteraksi dengan pelbagai sasaran, mengawal fungsi sel dan ekspresi gen downstream. Salah satu mekanisme yang mereka gunakan ialah sebagai RNA-endogen yang saling bersaing (ceRNA), di mana lncRNAs berinteraksi dengan miRNAs untuk memodulasi ekspresi gen downstream. Sebagai contoh, lncRNA TCONS_00021785 meningkatkan ekspresi enzim ligase E3 Trim33 dengan merampas miR-21-5p, yang seterusnya berpengaruh pada pengaktifan trypsinogen. LncRNA NONRATT022624 dan NONRATT031002 meningkatkan ekspresi faktor transkripsi ER1 dengan interaksi dengan miR-214-3p dan miR-764-5p masing-masing, yang bertindak balas terhadap pengaktifan trypsinogen. Mengenai pengaruh pada permulaan autophagy, lncRNA PVT1 merangsang ekspresi beclin1 dan lncRNA FENDRR menekan ekspresi ATG7 dengan berkaitan kepada protein pengikat RNA PRC2 yang interaksi dengan promoter ATG7. Walaupun NEAT1 terlibat dalam pelbagai jenis kanser dan keadaan meradang, perannya dalam perkembangan pankreatitis masih tidak jelas.
Dalam kajian ini, kami menggunakan teknologi pengurutan RNA untuk menganalisis profil ekspresi transkrip pada peringkat awal pankreatitis akut menggunakan model tikus, dan menganggap hubungan fungsinya melalui analisis Gene Ontology (GO) dan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Kami juga membina rangkaian ceRNA untuk memahami interaksi antara lncRNAs dan mRNAs. Selain itu, kami mengesahkan bahawa NEAT1 berfungsi sebagai sasaran terapeutik dengan mengatur pyroptosis bergantung kepada RHOB/NLRP3/GSDMD semasa perkembangan pankreatitis akut, yang memberikan dasar teoritis baru untuk strategi rawatan klinikal dan intervensi awal dalam pankreatitis akut.
Bahan dan Kaedah
Mice dan Reagen
Kami menggunakan strain C57BL/6 yang merupakan tikus jenis wild-type dari Vital River Laboratory Animal Technology di Beijing, China. Tikus knockout Neat1 (Neat−/−) diperolehi dari Model Animal Research Center di Nanjing, China. Tikus-tikus ini dibesarkan dalam persekitaran bebas patogen di Wenzhou Medical University (WMU) dalam suhu tetap 25°C dengan regimen pencahayaan 12 jam cahaya diikuti 12 jam gelap. Untuk eksperimen pankreatitis akut, tikus jantan berumur 8 hingga 10 minggu dipilih. Semua eksperimen yang melibatkan tikus mematuhi garis panduan etika yang ditetapkan oleh National Institutes of Health untuk penjagaan dan penggunaan haiwan, dan semua protokol telah mendapat kelulusan dari Scientific Investigation Board of Wenzhou Medical University. Antibodi utama yang digunakan termasuk GAPDH, RhoB, NLRP3, GSDMD, MPO, Caspase-1, dan cleaved-Caspase-1. Sekunder antibodi termasuk HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG dan HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG. L-Arginine dihantar dari Sigma-Aldrich, dan Cerulein diperoleh dari MedChemExpress.
Model AP Eksperimen Mice
Sebelum men induce AP atau SAP, semua tikus yang berumur 8 minggu dihadapkan dengan puasa selama 8 jam. Selanjutnya, tikus dipecahkan secara rawak dan dibahagikan kepada grup seperti yang ditunjukkan (n=3 setiap grup) dan diberi 200 ul cerulein pada dos 200 ug/kg/jam, diberikan secara intraperitoneal dalam 10 dos, atau dengan L-Arginine 2.5 g/kg secara intraperitoneal dalam dua dos dengan jarak 1 jam antara dos. Tikus di eutanasi menggunakan penyedutan karbon dioksida (CO2) pada 1 atau 12 jam setelah pengindusan AP. Serum dan tisu pankreas diambil untuk analisis. Untuk pemeriksaan histologi, pankreas dipek ke dalam 4% paraformaldehid, manakala untuk pengambilan RNA, mereka diawetkan dalam RNAlater. Di samping itu, pankreas yang baru dikeluarkan telah dibekukan dengan cepat untuk menganalisa protein dan analisis Western blot.
Pengukuran Enzim Amilase dan Lipase dalam Serum
Darah dikumpulkan dari model tikus pankreatitis akut dan ditinggalkan untuk membeku pada suhu bilik selama 30 minit. Serum kemudian dipisahkan melalui pendorongan pada 4000 rpm. Tingkatkan aktiviti amilase dan lipase menggunakan kit yang dipatuhi oleh pengeluar.
Pengambilan Protein dan Western Blotting
Tisu pankreas yang dibekukan dan dihomogenkan dalam buffer lisis Triton X-100, kemudian kuantiti protein diukur menggunakan Kit Ujian Protein BCA. Protein yang disamakan dilarikan melalui SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF, yang kemudian dibekukan dengan susu skim dan diinkubasi dengan antibodi utama. Selepas pencucian, jalur yang reaktif divisualisasikan dengan kit chemiluminescence dan ditekatkan dengan sistem pengimejan iBright FL.
Pemeriksaan Histologi Pankreas, Immunohistochemistry, dan Pengesanan Tahap Myeloperoksidase (MPO)
Pankreas diambil 12 jam setelah induksi UP, diperbaiki dalam larutan paraformaldehid, diembed dalam lilin parafin, dihiris menjadi 5-μm dan dilakukan pewarnaan dengan hematoksilin dan eosin (H&E), antibodi MPO. Pankreas dari pelbagai kumpulan dihomogenkan dalam PBS dan diuji untuk aktiviti MPO menggunakan kit ELISA.
Pengasingan RNA dan PCR Kuantitatif
RNA diasingkan dari tisu pankreas menggunakan reagen TRIzol. Selepas itu, kami melakukan transkripsi balikan untuk pengesanan mRNA dan miRNA sebelum melaksanakan PCR masa nyata.
Pengambilan Data RNA-Sequencing, Kawalan Kualiti, dan Pemprosesan
RNA diasingkan dari pankreas model tikus, dan kualiti serta konsentrasi diukur. Perpustakaan dibina menggunakan kit TruSeq Stranded mRNA dan di urut menggunakan sistem HiSeq X10. Data RNA-Seq diproses menggunakan Trimmomatic dan dianalisis dengan menggunakan kadar bacaan gen.
Pembinaan Rangkaian lncRNA-miRNA-mRNA
Kami memprediksi interaksi antara miRNAs dan DEMs/DEGs menggunakan perisian mircode dan Targetscan. Setelah mengintegrasikan hasil prediksi, kami membina rangkaian ceRNA untuk memahami fungsi RNA panjang pada patogenesis SAP.
Analisis Statistik
Data ditunjukkan sebagai purata ± sisihan piawai (SD). Ujian normaliti dilakukan sebelum analisis. Untuk data yang mengikuti distribusi normal, ujian t dua hala digunakan untuk membandingkan dua grup, sementara ANOVA satu hala dan ujian post-hoc Tukey digunakan untuk lebih dari dua grup.
Hasil
Analisis mRNA yang Diekspresikan Secara Berbeza, Termasuk Penilaian Gene Ontology dan Jalur KEGG
Dari analisis RNA-sequencing, kami mendapati 1522 mRNA diekspresikan secara berbeza di grup AP, dengan 839 meningkat dan 683 menurun berbanding grup kawalan. Kami juga melakukan analisis GO dan KEGG.
Perbezaan Ekspresi lncRNAs dan Pembinaan Rangkaian lncRNA-miRNA-mRNA
Analisis RNA-Seq menunjukkan terdapat 261 lncRNA yang dikesan berubah. Pembangunan rangkaian ceRNA membolehkan kami untuk memahami hubungan antara lncRNAs dan miRNAs.
Pengesahan LncRNAs dan mRNAs yang Berbeza
Kami mengesahkan ekspresi lncRNAs dan mRNAs yang terpilih, menunjukkan hasil yang konsisten dengan RNA Sequencing. Khususnya, lncRNA NEAT1 muncul sebagai regulator utama dalam rangkaian ceRNA.
Knockout LncRNA Neat1 Mengurangkan Pankreatitis Induksi Cerulein
Model cerulein AP dibina untuk menilai kesan knockout Neat1, dengan hasil menunjukkan bahawa penghapusan Neat1 menghalang simptom pankreatitis. Analisis mendapati penurunan aktiviti MPO dan tahap amilase serta lipase serum dalam model cerulein.
Knockout Neat1 Menghalang Pyroptosis dalam Model AP/SAP
Data menunjukkan bahawa knockout Neat1 mengurangkan ekspresi protein yang berkaitan dengan pyroptosis, menandakan bahawa NEAT1 memainkan peranan penting dalam patogenesis AP/SAP.
Diskusi
Pankreatitis akut adalah penyakit yang banyak terjadi dan boleh mendatangkan maut. Kebanyakan pesakit dapat pulih dalam 1-2 minggu, sementara 20% lagi berisiko tinggi untuk SAP yang lebih serius. Meskipun ada banyak penelitian, penemuan baru dalam rawatan pankreatitis masih terhad. Kajian ini menyarankan bahawa NEAT1 sangat berperanan dalam proses pyroptosis di AP, dan pengawalan oleh NEAT1 mungkin dapat memberi peluang baru untuk tujuan terapeutik.
Kadar jangka hayat sel pankreas meningkat setelah penghapusan NEAT1, mencadangkan bahawa pengawalan NEAT1 harus dieksplorasi lebih lanjut. Walaupun ini adalah kajian pertama yang meneliti kesan terapeutik NEAT1 dalam model tikus, terdapat beberapa batasan. Penelitian masa depan seharusnya lebih fokus pada mekanisme mengapa NEAT1 memainkan peranan penting di AP untuk mengembangkan rawatan yang lebih berkesan.
Kesimpulan
Hasil kajian ini mencadangkan bahawa NEAT1 berlebihan dalam AP dan mungkin mempengaruhi perkembangan pyroptosis. Penemuan ini mungkin memberi petunjuk baru untuk memahami patogenesis AP dan pengembangan strategi rawatan yang lebih baik. Eksperimentasi lanjut untuk mengembangkan sasaran terapi terhadap NEAT1 dalam pesakit pankreatitis harus dicari.
Penyataan Pembahagian Data
Data yang digunakan untuk menyokong hasil kajian ini boleh didapati atas permintaan dari penulis yang bersangkutan. Dataset yang dipersembahkan dalam kajian ini boleh dijumpai di repositori dalam talian dengan nombor akses: GSE272464.
Kelulusan Etika dan Persetujuan Diberikan
Semua prosedur haiwan dijalankan mengikut panduan yang diluluskan oleh Institutional Animal Care and Use Committee di Wenzhou Medical University.
Sumbangan Penulis
Semua penulis memberi sumbangan besar kepada kerja ini, dan menyatakan bahawa mereka setuju untuk bertanggungjawab terhadap semua aspek kerja ini.
Pembiayaan
Kerja ini disokong oleh PhD Start-up Funding dari Hospital Utama Wenzhou Medical University dan projek teknologi Wenzhou.
Pendedahan
Penulis tidak mempunyai konflik kepentingan untuk dinyatakan mengenai kerja ini.
